Определение de novo комариных структур Cry11Aa и Cry11Ba из природных

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4376 (2022) Цитировать эту статью

2696 Доступов

3 цитаты

17 Альтметрика

Подробности о метриках

Cry11Aa и Cry11Ba — два наиболее сильнодействующих токсина, продуцируемые комарицидной палочкой Bacillus thuringiensis subsp. israelensis и jegathesan соответственно. Токсины естественным образом кристаллизуются внутри хозяина; однако кристаллы слишком малы для определения структуры на синхротронных источниках. Поэтому мы применили серийную фемтосекундную кристаллографию на рентгеновских лазерах на свободных электронах к выращенным in vivo нанокристаллам этих токсинов. Структура Cry11Aa была определена de novo с использованием метода одноволновой аномальной дисперсии, что, в свою очередь, позволило определить структуру Cry11Ba методом молекулярного замещения. Эти две структуры открывают новый паттерн кристаллизации токсинов Cry in vivo, при котором каждый из трех их доменов упаковывается с симметрично идентичным доменом, а мотив упаковки расщепляемых кристаллов расположен внутри протоксина, а не на концах. Разнообразие моделей кристаллизации in vivo позволяет объяснить различные уровни токсичности и рациональные подходы к улучшению этих токсинов для борьбы с комарами.

Наиболее часто используемые биологические инсектициды для борьбы с популяциями комаров и мошек-переносчиков производятся бактерией Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), обнаруженный в Израиле в 1976 году1. Эти продукты воздействуют на личиночную стадию широкого спектра переносчиков и благодаря своей высокой эффективности и экологической безопасности заменили синтетические химические инсектициды широкого спектра действия во многих программах борьбы с переносчиками. К ним относятся Anopheles gambiae и родственные виды, которые передают малярию, а также многочисленные виды Culex и Aedes, которые распространяют вирусы, например те, которые вызывают западнонильский энцефалит и желтую лихорадку. Продукты Bti также используются в Африке для регулирования видов мошек, ответственных за перенос филярийных червей, вызывающих речную слепоту. Помимо популяций переносчиков, они используются для борьбы с надоедливыми комарами в долине Рейна в Германии, в Камарге на юге Франции, а также по всей территории США, Азии, Латинской и Южной Америки; за последние 30 лет были применены тысячи тонн.

Высокоэффективная противомоскитная активность Bti обусловлена ​​тремя нанокристаллическими формами четырех протоксинов, а именно. Cyt1Aa, Cry11Aa и сокристаллизованные Cry4Aa и Cry4Ba. Они производятся во время споруляции и чрезвычайно стабильны в различных условиях, но растворяются после проглатывания при высоких щелочных уровнях pH, характерных для средней кишки личинок комара2. Солюбилизированные протоксины активируются протеазами кишечника насекомых, что обеспечивает связывание с мембранами клеток кишечника, последующую олигомеризацию и, в конечном итоге, лизис клеток кишечника, что приводит к гибели личинок2. Токсины Bti экологически безопасны, поскольку они гораздо более специфичны для целевых комаров, чем химические ларвициды широкого спектра действия.

Самым мощным из четырех токсинов Bti является Cry11Aa, но его активация и механизм токсичности плохо изучены, во многом потому, что в отличие от Cry4Aa, Cry4Ba и Cyt1Aa его структура неизвестна. Родственный токсин, продуцируемый Bt subsp. джегатезан (Btj) представляет собой Cry11Ba, который в семь-тридцать семь раз более токсичен, чем Cry11Aa, в отношении основных видов комаров-переносчиков, принадлежащих к родам Aedes, Anopheles и Culex3, а у некоторых бактерий-хозяев он образует кристаллы немного большего размера. Структура Cry11Ba также неизвестна, хотя он использовался в качестве замены Cry11Aa в рекомбинантных штаммах Bti для значительного улучшения комарицидной активности3,4. Таким образом, наша цель состояла в том, чтобы определить структуру протоксинов Cry11Aa и Cry11Ba, чтобы понять, как они достигают образования прочных кристаллов, лабильных только при щелочном pH, и получить структурные данные для повышения эффективности этих белков в борьбе с комарами.

Определение структуры протоксинов Cry11Aa и Cry11Ba из природных нанокристаллов требует передовых технологий. Обычная кристаллография ограничивается проектами, в которых кристаллы достаточно велики, чтобы их можно было устанавливать и колебаться индивидуально в синхротронном рентгеновском луче. В прошлом кристаллы активированных Cry4Aa5, Cry4Ba6 и Cyt1Aa7 достигали достаточного размера путем выращивания их in vitro из токсинов, растворенных в природных нанокристаллах, и ферментативной активации токсинов. Однако Cry11Aa и Cry11Ba не перекристаллизовываются in vitro из растворенных нанокристаллов8. Более того, ферментативная активация нежелательна, поскольку наша цель — понять механизм растворения природных кристаллов, контролируемый pH. Чтобы наблюдать состояние протоксина в природных нанокристаллах, образующихся в бактериальных клетках, мы применили серийную фемтосекундную кристаллографию (SFX) на рентгеновских лазерах на свободных электронах (XFEL)9,10,11. В эксперименте SFX импульсы луча XFEL высокой яркости, каждый из которых длится всего ~ 10–50 фс, перехватывают серию нанокристаллов, по одному импульсу на кристалл, вызывая максимально сильный дифракционный сигнал от каждого крошечного кристалла перед его испарением и создавая серия дифракционных снимков, позже собранных в полный набор данных. Осуществимость этой стратегии была продемонстрирована недавним выяснением полного каскада биоактивации Cyt1Aa12.